La riscrittura del genoma diventa a prova di errore

Il sistema CRISPR-Cas9 per l’editing genomico permetterà la cura di malattie oggi incurabili. Le tecnologie sviluppate presso il CIBIO di Trento possono dare un significativo contributo all’avvicinamento di questa tecnologia alla pratica clinica.
Di Antonio Casini - Ricercatore presso il CIBIO - Università di Trento - Vincitore del Premio Sapio Ricerca Junior

Il genome editing, ovvero la modifica accurata e precisa del genoma di una cellula (sia questa umana, animale o vegetale) rappresenta forse una delle applicazioni biotecnologiche più promettenti di sempre ed avrà un grande impatto sulla nostra vita quotidiana. Il genoma di una cellula potrebbe essere paragonato al progetto per un ingranaggio meccanico estremamente complesso, ne specifica le caratteristiche e ne definisce le funzioni: avere la capacità di modificare questo progetto ci fornisce la chiave per plasmare a nostro piacimento le caratteristiche e il comportamento della cellula bersaglio.

Il 2012 ha visto esplodere una vera e propria rivoluzione nel campo del genome editing, una rivoluzione di nome CRISPR-Cas9 (si pronuncia crisper).

Questo sistema, identificato decenni prima nei batteri e caratterizzato nel suo funzionamento grazie all’impegno di numerosi gruppi di ricerca nel mondo, ha fornito ai ricercatori un paio di “forbici molecolari” in grado di tagliare il DNA all’interno di una cellula, semplificando il processo che porta alla riscrittura di porzioni del suo patrimonio genetico. Queste, in aggiunta, non sono forbici molecolari banali: possono infatti essere programmate con estrema facilità per dirigersi verso un bersaglio di nostro interesse (corrispondente ad una particolare sequenza di DNA). Una molecola di RNA, chiamata RNA guida e facilmente sintetizzabile in laboratorio, agisce come una sorta di guinzaglio interagendo con la proteina Cas9 e ancorandola al bersaglio di DNA in modo tale da dirigere l’attività di taglio nel punto desiderato.

La flessibilità e la semplicità di questo nuovo strumento molecolare hanno favorito la sua diffusione a macchia d’olio non solo in moltissimi laboratori di ricerca, ma anche all’interno di industrie biotecnologiche e farmaceutiche. L’impatto pratico di CRISPR-Cas9 si sta dimostrando immediato, allo studio ci sono infatti impieghi per il miglioramento genetico di piante da coltivazione, animali da allevamento o microrganismi di interesse industriale in cui le modificazioni genetiche possono essere usate per indurre la comparsa di caratteristiche vantaggiose, un po’ come si è fatto con gli incroci selettivi dall’alba dei tempi, ma arrivando al risultato desiderato in maniera più mirata e con una drastica riduzione dei tempi. Un altro campo in cui CRISPR-Cas9 promette cambiamenti radicali è quello medicale.

Per la prima volta nella storia della medicina è possibile immaginare la cura definitiva per patologie genetiche prima non aggredibili, semplicemente eliminando o correggendo il difetto genetico che ne è alla base. Da questo punto di vista, a dimostrazione della validità di questa tecnologia, dovrebbero partire proprio per quest’anno le prime sperimentazioni cliniche su pazienti facenti uso della forbice molecolare CRISPR-Cas9. Tali sperimentazioni interesseranno inizialmente alcune patologie del sangue, tra cui la beta-talassemia e l’anemia falciforme. Seppur in modo più indiretto, questa forbice molecolare ci potrà essere d’aiuto anche per la lotta ai tumori, facilitando la modificazione di alcune cellule del sistema immunitario del paziente, chiamate linfociti T, in modo tale da addestrarle a riconoscere e distruggere le cellule tumorali più efficacemente una volta infuse nel paziente dopo la loro modifica effettuata in laboratorio. Vi sono tuttavia alcune limitazioni nell’uso di CRISPR-Cas9.

Una delle principali è legata alla possibilità che questa forbice molecolare, una volta programmata per colpire la sequenza genomica prescelta, oltre a quel taglio vada a modificare e danneggiare altre regioni genomiche che sono soltanto simili al bersaglio desiderato. Questo può accadere poiché il genoma, soprattutto quello degli organismi più complessi, è un’entità molto articolata e non è infrequente individuare al suo interno sequenze ripetute o estremamente simili tra loro. Questa limitazione assume particolare rilievo se pensiamo all’utilizzo di Cas9 in ambito medico: in questo caso lo scopo che ci prefiggiamo è correggere gli errori nel DNA che stanno alla base dello sviluppo di patologie genetiche, di conseguenza l’idea di poterne introdurre di nuovi, senza la certezza di sapere se e quali effetti collaterali essi possano causare, chiaramente non rassicura il ricercatore in primis, ma neppure le autorità che sorvegliano le sperimentazioni cliniche. In secondo luogo, non sempre è facile introdurre all’interno delle cellule bersaglio i componenti del sistema CRISPR necessari per effettuare le modificazioni genomiche desiderate, soprattutto se si vogliono colpire cellule o organi all’interno del corpo del paziente. Il lavoro di ricerca svolto nel nostro laboratorio al CIBIO dell’Università di Trento, guidato dalla Prof.ssa Anna Cereseto, mira proprio ad affrontare queste tematiche proponendo soluzioni innovative in grado di avvicinare la tecnologia CRISPR alla pratica medica, riducendo i rischi per il paziente. Circa tre anni fa, ci siamo impegnati in un progetto di ricerca volto all’identificazione di una variante della forbice molecolare Cas9 che fosse più precisa nell’effettuare tagli nel genoma, non mancando mai il bersaglio genetico per cui è stata programmata.

A dimostrazione della necessità di trovare una soluzione a questo problema, oltre a noi altri gruppi di ricerca nel mondo hanno affrontato la stessa sfida, e tra questi anche ricercatori appartenenti alle prestigiose Università americane del MIT e di Harvard. Questi ricercatori hanno cercato di risolvere razionalmente il problema, determinando a tavolino al meglio delle attuali conoscenze in quale modo andasse modificata Cas9 per ottenere il desiderato aumento di specificità. L’approccio che abbiamo scelto ci distingue da tutti i nostri “concorrenti”: ricostruire un processo evolutivo molto semplificato in laboratorio per fare in modo che la Natura stessa ci assistesse nell’individuare una forbice molecolare infallibile. Ci siamo dunque lasciati aiutare da un microrganismo molto noto anche fuori dai laboratori di ricerca, il lievito di birra, da noi modificato in modo da poter diventare un efficiente ed affidabile indicatore della specificità di taglio della forbice Cas9. In particolare, le cellule del nostro lievito indicatore, se messe a crescere nelle opportune condizioni, sono in grado di cambiare colore (da bianco a rosso) in risposta all’accuratezza con cui Cas9 sta tagliando il suo bersaglio al loro interno.

Il cambiamento di aspetto ha permesso a noi ricercatori, un po’ come fanno gli allevatori scegliendo il cavallo migliore, di isolare i lieviti che segnalavano le caratteristiche di precisione migliori, selezionando di conseguenza anche la variante di Cas9 più specifica contenuta al loro interno. Partendo da una collezione molto vasta di mutanti di Cas9 generati casualmente ed introducendola nel nostro lievito-indicatore, questo processo di selezione ci ha permesso di isolare i mutanti ancora attivi nel tagliare il loro bersaglio e caratterizzati da un’aumentata specificità.

Dopo un ulteriore processo di ottimizzazione in cellule umane siamo riusciti ad isolare un “cocktail” di mutazioni perfetto, in grado di trasformare la Cas9 naturalmente presente nei batteri in evoCas9, una forbice molecolare evoluta rispetto a tutte le altre varianti disponibili e priva di effetti collaterali nel taglio. Accurate analisi ci hanno permesso di stabilire che la nostra evoCas9 riesce a ridurre del 99% la quantità di errori commessi durante la modificazione del genoma. Questa alta specificità, che si avvicina molto alla precisione assoluta nel taglio, rende evoCas9 la più accurata forbice molecolare per DNA attualmente presente e migliora sensibilmente i risultati precedentemente ottenuti dai gruppi di Harvard e MIT, dimostrando che l’approccio scelto dal nostro gruppo di ricerca si è alla fine rivelato vincente.

Le applicazioni per evoCas9 sono potenzialmente immediate: pensiamo per esempio a tutte quelle malattie genetiche in cui una copia di un nostro gene (ne ereditiamo una da nostra madre e una da nostro padre, quindi abbiamo due copie, dette alleli, di ogni nostro gene) contiene una mutazione che la rende tossica per la cellula e impedisce all’allele sano di funzionare. Un esempio in questo senso sono alcune forme di retinite pigmentosa. In questi casi l’eliminazione selettiva della copia malata del gene dal genoma, lasciando che la controparte sana sia libera di ristabilire il normale funzionamento della cellula, promette di essere una strada verso la cura definitiva della patologia. Ci si potrebbe chiedere: perché evoCas9 dovrebbe essere necessaria? La risposta sta nel fatto che molte di queste mutazioni si riducono al cambiamento di una singola lettera nella sequenza di DNA che compone il gene in questione. Differenze così piccole difficilmente sono discriminate dalla Cas9 naturale, mentre sono efficientemente riconosciute dalla nostra forbice super precisa evo- Cas9. Inoltre, in generale, avere a disposizione una forbice molecolare che molto somiglia ad uno strumento chirurgico per il genoma, privo di effetti collaterali, rende qualsiasi terapia genetica più sicura per il paziente, indipendentemente dal tipo di mutazione si preveda di colpire, e dovrebbe facilitare l’iter delle sperimentazioni cliniche.

Oltre ad avere delle forbici molecolari molto precise, è però anche necessario avere a disposizione dei metodi per introdurle efficacemente e in modo sicuro all’interno delle cellule bersaglio, meglio se direttamente nel corpo del paziente. Il nostro laboratorio si è impegnato anche in questo ambito, sviluppando un sistema di vettori virali, detto SLiCES (Self-Limiting Cas9 for Enhanced Safety), in grado di trasportare il gene codificante per Cas9 all’interno di una cellula bersaglio, garantendo però una presenza transiente della forbice molecolare grazie ad un interruttore di auto-spegnimento inserito nel vettore. In pratica, oltre a colpire il sito prescelto nel genoma della cellula, il nostro vettore istruisce Cas9 a tagliare e inattivare simultaneamente anche il gene che codifica per lei stessa, generando un auto-spegnimento della sua espressione. Ciò porta importanti vantaggi di sicurezza, tra cui una riduzione della risposta immunitaria contro le cellule modificate che potrebbe altrimenti insorgere data la presenza al loro interno di una proteina che, di fatto, proviene da batteri.

Tale risposta immunitaria sarebbe molto deleteria nell’ottica di una terapia basata su CRISPR, eliminando dall’organismo proprio le cellule con il DNA corretto e in grado di curare il paziente. CRISPR-Cas9 ha scatenato una vera rivoluzione della medicina, permettendo, tra le altre cose, la lotta a malattie genetiche prima incurabili. Le tecnologie da noi sviluppate, evo- Cas9 e SLiCES, possono dare un significativo contributo all’avvicinamento di questa tecnologia alla pratica clinica, aumentandone i margini di sicurezza e riducendo di conseguenza i rischi per il paziente. Essere stato scelto tra i vincitori del XVI Premio Sapio mi ha permesso di condividere l’emozione della scoperta scientifica con il pubblico al di fuori del laboratorio. Questo riconoscimento conferma il valore del lavoro che abbiamo svolto e mi motiva a proseguire negli sforzi e ad affrontare nuove sfide intellettuali, facendomi sentire riconosciuto e apprezzato in un Paese che alla ricerca pensa forse troppo poco. In questo senso la volontà di Sapio di istituire il Premio rappresenta una realtà virtuosa di grande aiuto per la comunità scientifica italiana e andrebbe presa come modello.



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