I microRNA nel tumore alla mammella: un'incoraggiante promessa per il futuro

È a questo che mirano la medicina e la ricerca più avanzate oggi: una medicina personalizzata. Per quanto possa risultare utopistica, più per i costi che per la fattibilità pratica, questo ambito di ricerca va sicuramente supportato e investigato.
Di Marilena V. Iorio - Responsabile MicroRNA - Start Up Unit, Istituto Tumori Milano

La deregolazione dell’espressione dei microRNA, piccole molecole di RNA non codificante in grado di regolare l’espressione genica a livello post-trascrizionale, è ormai considerata a tutti gli effetti una caratteristica chiave dei tumori umani. I microRNA hanno infatti un ruolo causale nel processo di tumorigenesi, promuovendo o inibendo i diversi step che portano dall’insorgenza alla progressione di una specifica neoplasia, attraverso la regolazione di molecole chiave. Non c’è probabilmente alcun fenomeno biologico, fisiologico o patologico, nel quale non intervengano i microRNA: proliferazione, differenziamento, migrazione cellulare, morte programmata, acquisizione di capacità metastastiche etc.

Dobbiamo pensare ai microRNA come a piccole pedine che intervengono in ogni processo della vita di una cellula, di un tessuto, di un organo, orchestrando una complessa sinfonia di pathway molecolari. Sono sempre esistiti, semplicemente sono stati ignorati per tanto tempo dalla comunità scientifica perchè si pensava fossero una sorta di scarto del genoma, prodotti di degradazione, una specie di rifiuto della cellula. Non è stato facile per la comunità scientifica accettare che il dogma gene-mRNA-proteina venisse drasticamente abbattuto: non solo non tutti gli RNA sono codificanti, ma la stragrande maggioranza non lo sono, e sequenze di soli 20 nucleotidi apparentemente senza significato hanno in realtà la capacità di controllare potenzialmente, e contemporaneamente, centinaia di geni. E c’è di più. Li controllano spesso in maniera tessuto specifica, e la loro alterata espressione e funzione porta ad un tale disequilibrio che causa l’insorgenza di diverse malattie, incluso il cancro.

Quando la scoperta dei microRNA e della loro associazione con i tumori umani sembrava già una novità sufficientemente sconvolgente da gestire per la comunità scientifica, ecco che il quadro si complica notevolmente. Ai microRNA si aggiungono nuovi RNA non codificanti, piccoli come i piRNA o più lunghi come i cosidetti lnc-RNA (long-non coding RNA), e non solo: nelle cellule possono esitere dei trascritti non codificanti, definiti pseudogeni, in grado di sequestrare i microRNA e impedirne l’azione sulle molecole bersaglio, evidenza che sottolinea meccanismi regolatori ancora più complessi di quanto inizialmente atteso. Ma negli ultimi anni moltissimi progressi sono stati raggiunti non solo nello studio del ruolo biologico dei microRNA nei tumori umani, ma anche nell’investigazione delle potenziali applicazioni cliniche, e delle eventuali concrete possibilità di trasferire le scoperte dal bancone di laboratorio al letto del paziente. L’espressione differenziale dei microRNA in diversi sottotipi tumorali, per esempio, ne sottolinea la specificità e il potenziale diagnostico, e in alcuni casi l’associazione con la prognosi dimostra la loro capacità di predire la progressione della malattia.

Tuttavia le applicazioni più importanti sono la possibilità di utilizzarli come marcatori di risposta a specifiche terapie, e allo stesso tempo come bersagli o strumenti per una terapia mirata. Una delle problematiche più importanti ed urgenti nella medicina oncologica è infatti rappresentata tutt’oggi dalla resistenza alle terapie, sia intrinseca che acquisita (quando il paziente inizialmente risponde e il tumore sviluppa poi meccanismi che lo rendono capace di resistere al trattamento, diventando più aggressivo o evadendo il controllo del sistema immunitario etc). L’identificazione di biomarcatori che predicano l’efficacia della risposta ad un determinato trattamento permetterebbe di selezionare accuratamente i gruppi di persone che beneficeranno effettivamente di quel tipo di farmaco, risparmiando in caso contrario inutili effetti collaterali ed evitando di rimandare la ricerca di terapie alternative.

Dopo numerosi sforzi effettuati tramite analisi del profilo di espressione genica dei tumori, la nuova promessa nella ricerca di biomarcatori predittivi è rappresentata proprio dai microRNA. Inoltre, viste le loro piccole dimensioni e la loro relativa stabilità rispetto ad RNA più lunghi, come gli mRNA, i microRNA possono essere facilmente detectabili in liquidi biologici come il sangue. Chiaramente l’identificazione di uno specifico pannello di microRNA circolanti, ovvero presenti nel sangue, capaci di predire la risposta ad uno specifico trattamento rappresenterebbe una metodica veloce, non invasiva, ed accurata che aiuterebbe la scelta della terapia migliore per ogni singolo paziente.

È a questo che mirano la medicina e la ricerca più avanzate oggi: una medicina personalizzata. Per quanto possa risultare utopistica, più per i costi che per la fattibilità pratica, questo ambito di ricerca va sicuramente supportato ed investigato. Ed è proprio sul potenziale dei microRNA come biomarcatori predittivi nel tumore alla mammella che si è focalizzata la mia ricerca negli ultimi anni.

Dati preliminari (non ancora pubblicati) ottenuti in vitro su linee cellulari di carcinoma della mammella indicano che la modulazione di HER3, tramite overespressione del miR-205 o silenziamento diretto tramite transfezione di un siRNA, aumenta la risposta a trattamento con Trastuzumab, riducendo la vitalità cellulare, la proliferazione, la capacità clonogenica. Inoltre, la valutazione dell’espressione del miR-205 in campioni tumorali di carcinoma della mammella HER2+ prelevati al momento della chirurgia in pazienti trattate successivamente (in adiuvante) con Trastuzumab ha permesso di determinare che alti livelli del miR-205 sono associati a migliore prognosi. Non solo quindi un miRNA può potenzialmente predire la risposta ad un determinato trattamento, ma la modulazione della sua espressione può rappresentare un valido strumento terapeutico adiuvante in combinazione con trattamenti standard. Sulla base di questi incoraggianti dati preliminari, abbiamo applicato ed ottenuto autorizzazione per studiare l’espressione del miR-205 in particolare, ma più in generale di effettuare un’analisi del profilo di espressione dei microRNA, in una grossa casistica di pazienti (455) reclutate nel trial clinico NeoALTTO, dove il farmaco molecolare anti-HER2 (Trastuzumab o Lapatinib o entrambi) è stato dato in combinazione con chemioterapia in neo-adiuvante (prima della chirurgia).

L’associazione con la risposta patologica al farmaco e con la prognosi delle pazienti (presenza o meno di recidive), permetterà di identificare una signature, un pannello di miRNA con valore predittivo. Inoltre, la disponibilità di plasma delle stesse pazienti è una risorsa preziosa che permetterà di valutare se le modulazioni dei miRNA identificati nel tessuto tumorale si riscontrino anche nel sangue. Il miR-205 è stato ancora oggetto di interesse della mia attività di ricerca anche per studi più di base, volti a determinare il ruolo di questo microRNA nello sviluppo della ghiandola mammaria e nel processo di tumorigenesi mediato dall’oncogene HER2. In collaborazione con l’Ohio State University (Columbus, OH, USA), abbiamo ottenuto un modello murino ingegnerizzato knock-out per il miR-205 (miR-205 KO), e dimostrato che la perdita del miR-205 provoca iperplasia della ghiandola mammaria, rendendo probabilmente il tessuto più suscettibile a trasformazione tumorale (dati non pubblicati). Ma i tumori HER2+ non sono l’unico sottotipo di tumore alla mammella: un altro sottogruppo, estremamente aggressivo e caratterizzato da cattiva prognosi, anche a causa dell’assenza di bersagli molecolari che permettano di effettuare terapie mirate, è quello dei tumori tripli negativi (così definiti per l’assenza di HER2, e dei recettori per estrogeno e progesterone). Un paio di anni fa abbiamo descritto una caratteristica peculiare di questo sottotipo tumorale, e di altri tumori estremamente aggressivi e sdifferenziati: la capacità di assumere il fenotipo e il comportamento di cellule endoteliali, partecipando alla formazione di lacune vascolari funzionali.

È come se tumori molto aggressivi si rendessero quasi indipendenti dalle cellule endoteliali dei vasi nel procurarsi nutrimento. Un processo diverso ed alternativo all’angiogenesi canonica, che abbiamo dimostrato essere principalmente dipendente dal recettore PDGFRß. Più recentemente, visto il potenziale dei microRNA come possibili strumenti terapeutici, abbiamo deciso di investigare il loro possibile ruolo nel fenomeno di endothelial differentiation. Ci siamo a tale scopo focalizzati su due microRNA in particolare, il miR-9, noto onco-miR (miRNA ad azione oncogenica) nel tumore alla mammella e in grado di promuovere la formazione di metastasi, e il miR-200, ben descritto oncosoppressore in grado di inibire il fenomeno di EMT (transizione epitelio-mesenchimale, associato ad aggressività del tumore) tramite targeting diretto del fattore trascrizionale ZEB1.

Abbiamo dimostrato che miR-9 e miR-200 esercitano un’azione opposta sul fenomeno di formazione delle lacune vascolari attraverso la regolazione della molecola chiave PDGFRß: il miR-9 è indotto in seguito ad attivazione del recettore e promuove la formazione di lacune vascolari, almeno in parte tramite regolazione diretta della molecola bersaglio STARD13; viceversa, il miR- 200 inibisce il fenomeno tramite targeting diretto di ZEB1 e conseguente downregolazione di PDGFRß. Abbiamo dimostrato tale fenomeno di differenziamento endoteliale sia in vitro che in vivo: in vitro abbiamo condotto saggi di tube formation, effettuati seminando le cellule su un supporto tridimensionale, che permette la formazione di una sorta di network, di rete, costituita da cellule connesse tra di loro; in vivo, in tumori originati da cellule di tumore alla mammella triplo negativo, il fenomeno è stato studiato su vetrino tramite analisi morfologica, immunoistochimica ed immunofluorescenza. In particolare, è stata valutata la contemporanea espressione di marcatori epiteliali (tipici delle cellule tumorali) quali le citocheratine, marcatori endoteliali quali il CD31, e il recettore PDGFRß in cellule tumorali che partecipano alla formazione di lacune vascolari, affacciandosi sul lume di un vaso sanguigno senza la co-presenza di una cellula endoteliale.

Ma non è tutto: il dato forse più interessante è che la modulazione in vivo dei due microRNA, ovvero l’overespressione del miR-200 e l’inibizione del miR-9 tramite delivery peritumorale di specifiche molecole (mimics del miR-200 ed inibitori del miR-9, rispettivamente) ha portato ad una significativa riduzione del fenomeno, suggerendo la possibilità di utilizzare questi due miRNA come strumenti, o bersagli, rispettivamente, per una terapia innovativa e specifica nei tumori tripli negativi della mammella. Recenti studi sottolineano inoltre un fenomeno interessante, che evidenzia come il tumore sia in grado di condizionare l’ambiente circostante e persino gli organi e i tessuti a distanza, creandosi un ambiente favorevole alla propria crescita e progressione: i microRNA possono essere rilasciati dalle cellule tumorali, incapsulati in microvescicole note come esosomi, e agire su cellule bersaglio. Rappresentano una sorta di “message in a bottle” della cellula tumorale, che cerca di “corrompere” il microambiente circostante al fine di crearsi alleati.

Noi abbiamo dimostrato che il miR-9 è rilasciato dalle cellule tumorali ed è in grado di contribuire alla trasformazione di fibroblasti normali in CAF (cancer-associated fibroblasts), contribuendo così alla trasformazione e progressione tumorale. Il nostro sforzo è ad oggi focalizzato alla comprensione dei meccanismi con cui il tumore riesce ad utilizzare i microRNA per evadere al controllo del sistema immunitario. Immaginiamo il tumore che rilascia un miRNA oncogenico come un pericoloso delinquente che consegna messaggi criptati per corrompere le forze dell’ordine. Bisogna identificare il meccanismo malato e combatterlo.



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